產(chǎn)品介紹

轉(zhuǎn)錄組測序的研究對象為特定細胞或組織在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的mRNA集合,通過oligo-dT磁珠捕獲帶polyA尾的RNA進行建庫測序,也稱為PolyA-Seq?？裳芯縨RNA差異表達或檢測結(jié)構(gòu)變異,篩選與疾病或性狀相關(guān)的分子標記;還可揭示轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性,確定基因以及轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)、可變剪接、RNA編輯、帶polyA尾的非編碼RNA 和新轉(zhuǎn)錄本。目前已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、分子育種、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。

? Total RNA提取:根據(jù)不同的樣品類型采用不同的提取方案,獲得高質(zhì)量的Total RNA。組學(xué)實驗

? RNA質(zhì)量檢測:Nanodrop檢測RNA樣品濃度及純度;瓊脂糖凝膠電泳及Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA樣品完整性。

? mRNA捕獲:采用oligo-dT磁珠捕獲帶Poly A結(jié)構(gòu)的mRNA

? RNA片段化:采用mg2+離子打斷的方法,將RNA片段化至200-300bp。

? cDNA合成:隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第①鏈;在合成cDNA第二鏈時摻入dUTP標記第二鏈,保留了RNA的鏈方向性(可選)。雙熒光素酶實驗

? 加A尾,接頭連接:cDNA兩端引入接頭序列及標記樣品的index序列。

? PCR富集:PCR富集文庫片段,文庫大小為300-400bp。

? 文庫質(zhì)檢:Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫大小分布,Qubit 3.0或熒光定量PCR測定文庫濃度。

? 上機測序:根據(jù)數(shù)據(jù)量要求將文庫pooling上機測序。

? 數(shù)據(jù)分析:下機數(shù)據(jù)由專業(yè)生物信息分析團隊進行數(shù)據(jù)分析,提供全面數(shù)據(jù)分析報告。

樣品要求

? 樣品類型:細胞、新鮮組織或RNA樣品。

? 樣品量:細胞樣品請?zhí)峁┲辽?×10⁶個細胞,組織樣品請?zhí)峁┲辽?00 mg的組織塊或切片,RNA樣品請?zhí)峁? μg以上的總RNA。

? 樣品質(zhì)量:RNA無明顯降解,提取的總RNA,OD260/280值在1.8~2.2之間,濃度≥500 ng/μL,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 7。

? 樣品保存:

 細胞樣品:收集細胞至RNase Free 1.5 mL EP管,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗一次,棄去PBS,把細胞沉淀保存在-80℃。

 組織樣品:組織樣品離體后放在凍存管中,迅速置于液氮下速凍1分鐘以上,然后保存在-80℃。

RNA樣品:可將RNA溶于RNase Free 的超純水中,-80℃保存。細胞動物整體實驗

 樣品保存期間避免反復(fù)凍融。

? 樣品運輸:樣品置于1.5 mL管中,封口膜封好,干冰運輸。

測序方案

測序模式 PE150

測序數(shù)據(jù)量 6Gb clean data

生物信息分析內(nèi)容

1 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控檢查

2 比對結(jié)果質(zhì)控檢查

3 基于基因表達的樣品主成分分析

4 差異基因表達分析

5 差異基因GO功能分析

6 差異基因通路分析

7 變異剪切分析

8 基因突變分析

9 轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性分析及通路互作分析