A 啟動(dòng)子活性分析

B 啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合驗(yàn)證

用于研究某轉(zhuǎn)錄因子是否調(diào)控某基因的啟動(dòng)子，以及它們的結(jié)合區(qū)域。

轉(zhuǎn)錄因子（TFs）是調(diào)節(jié)基因表達(dá)，以保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。研究轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子功能時(shí)，將啟動(dòng)子序列插入到報(bào)告基因載體（常用載體為pGL3-Basic Vector，將待檢測(cè)的啟動(dòng)子序列構(gòu)建在報(bào)告基因上游），同時(shí)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，分析熒光素酶表達(dá)水平，反映轉(zhuǎn)錄因子是否調(diào)控基因的表達(dá)。

確定轉(zhuǎn)錄因子與對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子有調(diào)控功能后，可以對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行截?cái)啵ňW(wǎng)站可以預(yù)測(cè)到的，根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行截?cái)嗷蛘咄蛔?；無(wú)法預(yù)測(cè)的可以直接每缺失500bp進(jìn)行截?cái)啵Ｍㄟ^(guò)熒光值對(duì)比確定哪一區(qū)域?yàn)楹诵膮^(qū)，luciferase表達(dá)強(qiáng)度的高低說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子能增強(qiáng)或抑制啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

注意：?jiǎn)?dòng)子截?cái)嗍侵鸩饺笔нh(yuǎn)端序列（因?yàn)楹诵膯?dòng)子位于靠近TSS端，缺失該處會(huì)喪失基本轉(zhuǎn)錄活性）；

C 研究microRNA與靶基因是否存在調(diào)控關(guān)系

microRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3’UTR起作用，microRNA大部分通過(guò)成熟體種子區(qū)與3’UTR結(jié)合抑制蛋白翻譯。可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至報(bào)告基因luciferase的下游，再共轉(zhuǎn)入microRNA，如果熒光素酶表達(dá)下降，可以說(shuō)明microRNA對(duì)目的基因的抑制作用，則待驗(yàn)證序列是microRNA靶序列。出于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目紤]，通過(guò)結(jié)合定點(diǎn)突變進(jìn)一步確定microRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。細(xì)胞動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)

D 5’UTR和3’UTR功能驗(yàn)證

對(duì)于編碼基因，通常都會(huì)有5’UTR和3‘UTR，這些編碼基因的5’UTR和（或）3‘UTR可能會(huì)對(duì)基因的表達(dá)有影響。 

研究5’UTR：將編碼基因的5’UTR構(gòu)建到pGL3 promoter載體的熒光素酶報(bào)告基因的上游，SV40啟動(dòng)子下游，通過(guò)這種結(jié)構(gòu)來(lái)判斷5UTR’對(duì)基因表達(dá)的影響。

而對(duì)于3’UTR：將編碼基因的3’UTR構(gòu)建到pGL3 promoter載體螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的下游，通過(guò)這種結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)3’UTR的功能，這里的3’UTR通常都是全長(zhǎng)。

E 位于增強(qiáng)子內(nèi)的非編碼性SNP

單個(gè)核苷酸變異，簡(jiǎn)稱SNP。

通過(guò)構(gòu)建報(bào)告系統(tǒng)研究SNP位點(diǎn)的增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子是否結(jié)合為直接，根據(jù)SNP位置不同，構(gòu)建方法也是不一樣的，具體如下：

1.SNP位于啟動(dòng)子區(qū)域（一般5k以內(nèi)）：直接構(gòu)建啟動(dòng)子全長(zhǎng)至PGL3 basic

2. SNP位于啟動(dòng)子上游遠(yuǎn)端：構(gòu)建SNP位置1k左右的序列與目的基因啟動(dòng)子聯(lián)合構(gòu)建至PGL3 basic

3.SNP位于基因內(nèi)含子或者基因下游：構(gòu)建SNP位置1k左右的序列至PGL3 promoter的luc下游，也可將載體本身SV40啟動(dòng)子替換為目的基因啟動(dòng)子。