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雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)的具體步驟

2022-11-18 15:55:14
次

1、報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建。將目的片段插入到熒光素酶表達(dá)的報(bào)告基因載體上，如pGL3-basic。

2、轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將報(bào)告基因質(zhì)粒和phRL-TK(內(nèi)參)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，根據(jù)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。共轉(zhuǎn)染時(shí)，由于內(nèi)參具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，因此報(bào)告基因質(zhì)粒：內(nèi)參轉(zhuǎn)染量一般為10:1~50:1。天津組學(xué)實(shí)驗(yàn)

Luciferase活性測(cè)定：

⑴ 初次使用時(shí)，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。將LAR II溶解在LAR II buffer中，并分裝-80℃避光保存。

天津組學(xué)實(shí)驗(yàn),雙熒光素酶實(shí)驗(yàn),qPCR

⑵ 加入1X PLB，室溫裂解細(xì)胞15 min。

⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能夠終止LAR II的反應(yīng)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

⑷ 測(cè)定熒光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul細(xì)胞裂解液，吹打混勻后，檢測(cè)讀數(shù)，即為Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次讀數(shù)，即為Renilla luciferase的值。qPCR

⑸ 數(shù)據(jù)處理。首先計(jì)算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control組的比值為單位1，即可得到不同處理組的相對(duì)luciferase活性，也就是該處理組基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控活性。


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