雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的原理是利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特點(diǎn)，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。通過(guò)熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。同時(shí)，為了減少內(nèi)在的變化因素對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（rinilla luciferase)的質(zhì)粒作為對(duì)照質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對(duì)照，使測(cè)試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾。

雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)的具體步驟

　　1、報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建。將目的片段插入到熒光素酶表達(dá)的報(bào)告基因載體上，如pGL3-basic。

　　2、轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將報(bào)告基因質(zhì)粒和phRL-TK(內(nèi)參)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，根據(jù)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。共轉(zhuǎn)染時(shí)，由于內(nèi)參具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，因此報(bào)告基因質(zhì)粒：內(nèi)參轉(zhuǎn)染量一般為10:1~50:1。

　　Luciferase活性測(cè)定：⑴ 初次使用時(shí)，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。將LAR II溶解在LAR II buffer中，并分裝-80℃避光保存。⑵ 加入1X PLB，室溫裂解細(xì)胞15 min。⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能夠終止LAR II的反應(yīng)。⑷ 測(cè)定熒光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul細(xì)胞裂解液，吹打混勻后，檢測(cè)讀數(shù)，即為Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次讀數(shù)，即為Renilla luciferase的值。⑸ 數(shù)據(jù)處理。首先計(jì)算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control組的比值為單位1，即可得到不同處理組的相對(duì)luciferase活性，也就是該處理組基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控活性。

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