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干貨分享：設(shè)計完美蛋白組學(xué)實驗的方法

2023-05-24 10:59:35
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七個步驟讓您擁有良好蛋白組學(xué)實驗設(shè)計






成功的實驗具有可重復(fù)性，且不會因為實驗室條件的不同該改變。實驗設(shè)計所用的技術(shù)、深入的處理方法都非常重要。下圖展示的是實驗設(shè)計的基礎(chǔ)流程，可幫助研究者無偏差而高效的完成蛋白組學(xué)實驗。





1.明確實驗?zāi)繕撕拖嚓P(guān)響應(yīng)變量






首先要明確實驗?zāi)繕耍纭皩y量什么”、“和哪個樣品組進行比較”等，這些是將要研究的響應(yīng)變量和實驗因素，以確定它們對實驗結(jié)果的影響。響應(yīng)變量是用來回答研究問題的實驗成果，在定量蛋白組學(xué)中是肽鏈或蛋白的豐度，在蛋白組學(xué)中是不同樣本中的差異蛋白。選擇實驗方法至關(guān)重要，有MRM、DDA、DIA等可選項。另外，還需要評估效應(yīng)大小以判斷需要的樣品用量。在早期的biomarker篩選階段，只要是顯著差異的就行，而在毒性研究中只有引起生理差異的才有價值。





2.列舉相關(guān)因素






相關(guān)因素是影響響應(yīng)變量的潛在因素。理想情況下響應(yīng)只受實驗系統(tǒng)中生理性質(zhì)的影響，但實際情況復(fù)雜得多。如肽段峰面積不僅取決于該肽的豐度，還取決于電噴霧的穩(wěn)定性、色譜柱殘留和蛋白水解效率。在實驗中改變的因素稱為實驗因素，它們對所有樣本的影響不一定都相同，例如試劑批次、一天運行LC-MS時的上樣順序和人為因素等，因此需要盡量將這些因素的影響降到可能小。





3.設(shè)置對照樣本和質(zhì)量控制步驟






在此可以設(shè)置2種對照：實驗對照和質(zhì)控樣品。前者保證樣品性質(zhì)如保留時間、m/z和豐度信息的準確性，后者可以設(shè)置已知豐度的蛋白，以評估儀器檢測的準確性。質(zhì)控樣本可以告知我們儀器是否正常運行，以及性能如何。評估有性能的分析軟件有NIST、QuaMeter tool和SProCoP等。





4.優(yōu)化實驗流程






供應(yīng)商的Protocols為實驗提供了關(guān)鍵部分的詳細流程，但為確保實驗正常進行還需調(diào)整多種參數(shù)。如安捷倫噴射流電噴霧電離源具有六種調(diào)節(jié)功能，有干燥氣體溫度、霧化器電壓和毛細管電壓等。但要使實驗系統(tǒng)整體正常運行，還需要調(diào)整其他許多參數(shù)。幸運的是有很多系統(tǒng)方法可以優(yōu)化設(shè)置，如RSM（Response Surface Methodology）。在發(fā)表的文章中也可找到多種優(yōu)化參數(shù)、提高蛋白組學(xué)性能結(jié)果的例子。





5.估算樣品數(shù)量






研究中需要避免因為樣品重復(fù)和技術(shù)重復(fù)不夠的問題，否則會出現(xiàn)假陽性/假陰性結(jié)果。因此，我們必須評估需要多少樣品并設(shè)計相應(yīng)實驗。這將涉及2點：一是我們探究的影響（信號）有多大，另外一個是組間樣品的響應(yīng)變量情況。通過預(yù)實驗來檢測噪音水平是實驗設(shè)計的關(guān)鍵步驟。作者推薦每組中至少設(shè)置10個獨立樣本以評估其變量，一個生物樣本測定5次。這將花費不菲，但從中獲得的知識是成功進行后續(xù)實驗的關(guān)鍵。





6.進行實驗






一個好的實驗設(shè)計應(yīng)該能回答研究問題，并且不會產(chǎn)生有偏差的實驗結(jié)果。現(xiàn)代實驗設(shè)計可以追溯到R.A. Fisher在1926年發(fā)表的工作。他奠定了實驗設(shè)計的三大里程碑：封阻、隨機性和重復(fù)性，前兩者可消除偏差，第三者可以增加信號-噪音的比率，得到更準確的結(jié)果。


 


01

封阻




很多因素會隨著實驗的進行而改變，如試劑批次、人為因素、日期等等。封阻是解決以上問題的辦法。運行一個小的平衡實驗。例如，如果每天只能運行八個樣本，那么可以從兩個組中各選擇4個樣本進行實驗，如此一來，響應(yīng)變量的任何變化對2個組中的影響都相同。




02

隨機性




有些實驗無法很好進行封阻，例如96孔板的邊緣對實驗結(jié)果有影響，這時候隨機分布樣本就能簡單有效的解決這個問題。隨機可以抵消未知因素引起的結(jié)果偏差，這在縱向收集樣本時尤為重要。圖2展示了一個隨機實驗設(shè)計的例子。



 


03

重復(fù)性




設(shè)置重復(fù)的目的是減少隨機測量偏差。重復(fù)分為生物學(xué)重復(fù)（多個獨立隨機樣本）和技術(shù)重復(fù)（多次測試），前者可以反映群落的整體情況，后者能消除實驗過程的噪音。例如，病人對治療的響應(yīng)各不相同，一個樣本得到的結(jié)果可能和群體平均信息相差巨大，因此需要設(shè)置多個樣本。而當實驗室程序引入的可變性達到或大于種群可變性的規(guī)模時，技術(shù)重復(fù)就顯得更重要了。像蛋白質(zhì)鑒定實驗中，通常依賴重復(fù)運行LC-MS/MS積累的數(shù)據(jù)來完善蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，那些變化大的步驟可通過流程優(yōu)化或技術(shù)重復(fù)來補救。
 
設(shè)置盲實驗能使結(jié)果更加具有說服力，對照樣本也是實驗中必須包含的部分，陰性/陽性樣本能驗證整個實驗工作流程是否正常運行，讓研究者解釋陽性結(jié)果的正確性。



7.統(tǒng)計分析





目前有很多分析平臺可以對蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)進行免費處理，包括蛋白鑒定、蛋白定量和統(tǒng)計分析。常用的方法是t檢驗和ANOVA，當然，也可以選擇非參數(shù)檢驗方法。進行封阻實驗的，在分析時還必須將其考慮在內(nèi)（以便在評估噪聲水平時忽略這些變量可能存在的巨大差異）。值得注意的是，統(tǒng)計方法必須與研究問題及實驗設(shè)計相匹配。


組學(xué)實驗


總  結(jié)



執(zhí)行一個好的實驗設(shè)計并不會比執(zhí)行差的設(shè)計花費更多努力。R. A. Fisher提出的三個重要準則是封阻、隨機和重復(fù)。建立正確的QCs能消除因系統(tǒng)因素而造成的實驗誤差，也能檢測到長期運行時性能的改變。鼓勵大家通過公共存儲庫（如proteomexchange.org）分享蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，這能減少不必要的重復(fù)研究，而且也能比較相似數(shù)據(jù)集的質(zhì)量和準確性。目前尚無運行LC-MS的質(zhì)量控制標準，而共享這些信息可以大大簡化調(diào)試和優(yōu)化蛋白質(zhì)組學(xué)實驗的過程。細胞動物整體實驗



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