螢火蟲(chóng)熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時(shí)存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生黃綠色光，波長(zhǎng)540-600nm，一般檢測(cè)時(shí)選用560nm。

海腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產(chǎn)生藍(lán)光，波長(zhǎng)460-540nm，一般檢測(cè)時(shí)選用460nm。

不同于綠色熒光蛋白（GFP）需要一定的光激發(fā)才能發(fā)光，且易淬滅；熒光素酶經(jīng)過(guò)反應(yīng)本身就可以自發(fā)熒光，并且只有在底物存在時(shí)才能發(fā)光。因此GFP只能用于標(biāo)記或檢測(cè)反應(yīng)是否發(fā)生，而熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)卻能通過(guò)熒光值定量分析熒光素酶的表達(dá)水平。

熒光素酶作為一種理想的報(bào)告基因，可用于啟動(dòng)子研究、miRNA研究、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究等等。

在報(bào)告基因的5'端加上待檢測(cè)基因的啟動(dòng)子，就可以用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的作用，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄越多，那報(bào)告基因的表達(dá)量就越大，熒光值越高。如果在報(bào)告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，就能用來(lái)檢測(cè)miRNA對(duì)于目的基因的調(diào)控（抑制作用），報(bào)告基因表達(dá)越少，說(shuō)明miRNA的作用就越強(qiáng)。

一般情況下，海腎熒光素酶基因作為內(nèi)對(duì)照使用，將帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；或是將兩個(gè)報(bào)告基因構(gòu)建到同一個(gè)質(zhì)粒上，分別用不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)其表達(dá)。計(jì)算結(jié)果時(shí)，將螢火蟲(chóng)熒光素酶的檢測(cè)值比上海腎熒光素酶檢測(cè)值，這樣就可以減少內(nèi)在變化因素對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，使測(cè)試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾。

正是由于報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果受多種因素影響，如載體狀態(tài)、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率、加樣精度、檢測(cè)過(guò)程等，一旦某個(gè)細(xì)節(jié)處理不好，都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或結(jié)果的不準(zhǔn)確。小翊為此精心整理了大家實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的幾類常見(jiàn)的問(wèn)題和解決辦法。

1.熒光值過(guò)高

熒光值過(guò)高可能會(huì)超出儀器檢測(cè)范圍，從而檢測(cè)不到值，一般讀數(shù)在5-6位之間較好。熒光值過(guò)高可通過(guò)以下方式嘗試解決：

2.熒光值過(guò)低或無(wú)熒光值

熒光素酶的表達(dá)水平與啟動(dòng)子活性相關(guān)，正常表達(dá)水平下檢測(cè)到的熒光值應(yīng)在10⁵數(shù)量級(jí)左右，若檢測(cè)到的熒光值比較低或無(wú)熒光值，可從啟動(dòng)子活性、轉(zhuǎn)染效率、檢測(cè)過(guò)程這幾方面進(jìn)行考慮：

實(shí)驗(yàn)原理

miRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結(jié)合位點(diǎn)突變型）序列構(gòu)建至載體中報(bào)告基因F-Luc的3’端，通過(guò)比較過(guò)表達(dá)miRNA后，報(bào)告基因表達(dá)的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），來(lái)確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。

案列介紹

題目: Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer

期刊: Nature Communications

小結(jié)：驗(yàn)證B4GALT3（β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶III）基因具有miR-1247-3p的靶向結(jié)合位點(diǎn)。將B4GALT3預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的序列克隆到報(bào)告基因載體，同時(shí)構(gòu)建靶位點(diǎn)突變的載體，分別共轉(zhuǎn)miR-1247-3p mimics及NC mimics，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-1247-3p 的WT組相對(duì)熒光值降低，MUT組不變，提示存在靶向結(jié)合。

  Tian Fang et al.,Nature communications，2018

相關(guān)實(shí)驗(yàn)：miRNA同lncRNA/circRNA靶向互作

實(shí)驗(yàn)原理

轉(zhuǎn)錄因子主要通過(guò)作用于靶基因的啟動(dòng)子起作用，將目的基因啟動(dòng)子區(qū)序列替換報(bào)告基因F-Luc的啟動(dòng)子，通過(guò)共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子后，報(bào)告基因表達(dá)的改變，來(lái)確定轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)及對(duì)靶基因的作用。

案列介紹

題目：Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop

期刊：Nature Neuroscience

小結(jié)：驗(yàn)證Sox9在Sox2啟動(dòng)子區(qū)有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建不同的啟動(dòng)子片段到報(bào)告基因載體中，共表達(dá)Sox9，顯示插入片段的縮短和推測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的減少，熒光素酶活性也隨之下調(diào)。

Jun Wang et al.,Nature neuroscience,2018

3 技術(shù)路線

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案—預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)--構(gòu)建野生/突變報(bào)告基因載體系統(tǒng)---共轉(zhuǎn)染細(xì)胞---檢測(cè)酶活

常用靶基因結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)址：

http://www.targetscan.org/

http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_dyn_data.html

http://www.mirbase.org/

常用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)址：

http://jaspardev.genereg.net/

http://www.genomatix.de/

http://alggen.lsi.upc.es

4常見(jiàn)應(yīng)用方向總結(jié)

（1）驗(yàn)證miRNA同mRNA靶向互作。將靶mRNA的3’UTR序列插入報(bào)告基因載體，再共轉(zhuǎn)入該miRNA，如果螢光素酶活性下降，則提示為其靶序列。?

（2）?驗(yàn)證miRNA同circRNA靶向互作。將circRNA序列插入報(bào)告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域，檢測(cè)螢光素酶活性。?

（3）?驗(yàn)證miRNA同lncRNA靶向互作。將lncRNA序列插入報(bào)告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域，檢測(cè)螢光素酶活性。

（4）啟動(dòng)子活性分析。將啟動(dòng)子區(qū)域序列進(jìn)行分段截短，再分別構(gòu)建入報(bào)告基因載體，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。

（5）?驗(yàn)證特定轉(zhuǎn)錄因子同啟動(dòng)子的作用。將啟動(dòng)子區(qū)域插入報(bào)告基因載體，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中共轉(zhuǎn)該轉(zhuǎn)錄因子，分析轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)是否提高螢光素酶活性。?

（6）分析信號(hào)通路是否激活。將該信號(hào)通路的下游響應(yīng)原件序列構(gòu)建入報(bào)告基因載體，在不同上游信號(hào)條件下，螢光素酶活性代表了通路的下游響應(yīng)。組學(xué)實(shí)驗(yàn)

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)常用載體

   雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)常用的載體有兩種策略。一是兩種熒光素分別位于兩個(gè)載體上，第二種是兩種熒光素酶位于同一個(gè)載體上。

策略一：兩種熒光素分別位于兩個(gè)載體。

（1）pRL-TK質(zhì)粒（海腎熒光素酶Rluc載體）：

（2）pGL3-Basic質(zhì)粒（螢火蟲(chóng)熒光素酶Luc載體）

將帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)值與海腎熒光素酶檢測(cè)值的比值，即可計(jì)算出過(guò)表達(dá)或者敲降轉(zhuǎn)錄因子對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的影響

第二種策略：兩種熒光素位于同一個(gè)載體

pmir-GLO質(zhì)粒將海腎熒光素酶（hRluc-neo fusion）與螢火蟲(chóng)熒光素酶（Luc2）構(gòu)建到一個(gè)質(zhì)粒載體，比雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染更加便捷。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)