雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)

近年來(lái),非編碼RNA(Non-coding RNA)的研究成為熱點(diǎn),特別是microRNA的研究。當(dāng)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的miRNA,并研究其是否對(duì)相關(guān)疾病具有調(diào)控作用時(shí),就需先對(duì)它和靶基因的調(diào)控關(guān)系做一驗(yàn)證,而目前常用的靶向關(guān)系的驗(yàn)證方法就是:雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。本文就相關(guān)檢測(cè)原理、螢火蟲熒光素酶、海腎螢光素酶、報(bào)告基因、檢測(cè)步驟、細(xì)胞裂解及Luciferase檢測(cè)作簡(jiǎn)單介紹。

檢測(cè)原理

由于miRNA主要是通過(guò)作用于靶基因的3'UTR區(qū)域,這樣就可以將目的基因3'UTR區(qū)域構(gòu)建至含有報(bào)告基因螢光素酶的載體上,通過(guò)比較miRNA mimics或miRNA inhibitor作用后報(bào)告基因表達(dá)的改變(監(jiān)測(cè)螢光素酶的活性變化)可以定量反映出miRNA對(duì)目的基因的抑制作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法還可以進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3'UTR的作用位點(diǎn)。

螢火蟲螢光素酶

螢火蟲熒光素是從甲蟲(Photinus pyralis)中分離得到,分子量為61kDa的蛋白,在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下,可以催化熒光素(luciferin)氧化成氧化熒光素(oxyluciferin),在luciferin氧化的過(guò)程中,會(huì)發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。螢火蟲螢光素酶催化luciferin發(fā)光的z強(qiáng)發(fā)光波長(zhǎng)為560nm。

海腎螢光素酶

海腎(Renilla)熒光素酶則是從海腎(Renilla reniformis)中分離,分子量為36kDa的蛋白,在氧氣存在的條件下,可以催化腔腸素(coelenterazine)發(fā)生氧化,在coelenterazine氧化的過(guò)程中也會(huì)發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。海腎螢光素酶催化coelenterazine發(fā)光的z強(qiáng)發(fā)光波長(zhǎng)為465nm。

生物螢光可以通過(guò)熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定,從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量。

報(bào)告基因

報(bào)告基因(report gene)是指一組編碼易被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因,可通過(guò)報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)來(lái)“報(bào)告”目的基因的表達(dá)調(diào)控。

檢測(cè)步驟

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染:

(1)轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞計(jì)數(shù),取2mL加入6孔板中,使得孔板的細(xì)胞密度不低于5*105個(gè);

(2)對(duì)于每孔細(xì)胞,用250uL的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2μg DNA(質(zhì)粒),室溫孵育5min;

(3)對(duì)于每孔細(xì)胞,用250uL的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋5uL Lipo2000,室溫孵育5min;

(4) 將2和3中的液體混合,室溫孵育20min;

(5) 將預(yù)先分好的貼壁細(xì)胞換成無(wú)血清培養(yǎng)基,加入上述復(fù)合物,在37℃,5%的CO2中培養(yǎng)6h,再換成完全培養(yǎng)基,繼續(xù)在37℃,5%的CO2中培養(yǎng),72h檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平。

細(xì)胞裂解及Luciferase檢測(cè)

RLU值的計(jì)算:在以海腎螢光素酶為內(nèi)參的情況下,用螢火蟲螢光素酶測(cè)定得到的RLU1值除以海腎螢光素酶測(cè)定得到的RLU2值。根據(jù)得到的比值來(lái)比較不同樣品間目的報(bào)告基因的激活程度。如果以螢火蟲螢光素酶為內(nèi)參,也可以進(jìn)行類似計(jì)算。

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

潛在啟動(dòng)子/啟動(dòng)子核心區(qū)域檢測(cè)

潛在增強(qiáng)子/抑制子等調(diào)控子核心元件檢測(cè)

啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因了結(jié)合位點(diǎn)檢測(cè)

啟動(dòng)子增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用

病毒/細(xì)胞相互作用

藥物等化學(xué)誘導(dǎo)因素對(duì)啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié) (抑制或增強(qiáng))

射線等物理誘導(dǎo)因素對(duì)啟動(dòng)了活性的調(diào)節(jié) (抑制或增強(qiáng))

microRNA靶基因驗(yàn)證

以雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行microRNA靶基因驗(yàn)證為例，介紹相關(guān)的實(shí)驗(yàn)流程

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